(一)培养基的基本知识
1.培养基的营养成分
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营养物质 |
定义 |
作用 |
主要来源及所涉及的微生物 |
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碳源 |
凡是能提供微生物所需碳元素的物质 |
构成生物细胞、生物体及细胞代谢产物，有些能为异养生物提供能源 |
无机化合物：C O 2、NaHC O 3等(自养生物) 有机化合物：糖类、脂质、花生粉饼、石油等(异养生物) |
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氮源 |
凡是能提供微生物所需氮元素的物质 |
合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物，也可为异养微生物提供能源 |
无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐，自养生物有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等，异养生物 |
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水分 |
生物体内含量最高的组成成分，分为结合水和自由水 |
良好的溶剂、细胞生活及生化反应的介质、参与物质运输及参与生化反应的反应物 |
培养基、大气、代谢产物 |
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无机盐 |
为微生物提供大量除C、H、 O 以外的各种元素 |
细胞组成成分，生命调节物质，自养菌的能源或其他营养来源，酶的激活剂 |
培养基、大气等环境 |
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生长因子 |
微生物正常生长繁殖，必不可少的微量有机物 |
可作为酶与核酸等的组成成分 |
维生素、氨基酸、碱基等 |
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高考警示钟 |
自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同 (1)自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。 (2)含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。 |
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2.培养基的配制原则
(1)目的明确。要根据微生物的种类、培养目的等选择原料、配制培养基。
(2)营养要协调。各种营养物质要保证适当的浓度和比例。营养物质比例过低，不能满足微生物生长;浓度过高则会抑制微生物的正常生长。营养物质的浓度比(如C/N)还会直接影响某些微生物的代谢产物，如谷氨酸生产，C/N=4∶1时，菌体大量繁殖，谷氨酸产量少;而C/N=3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大。
(3)pH要适当。不同微生物生长所需pH不同。如细菌pH保持在6.5～7.5之间;放线菌保持在7.5～8.5之间;真菌应保持在5.0～6.0之间。
3.培养基的分类及作用
培养基种类很多，作用也不同。根据不同的分类标准，可将培养基分为不同种类。
划分标准 | 培养基种类 | 特点 | 用途及实例 |
物理性质 | 液体培养基 | 不加凝固剂 | 工业生产 |
半固体培养基 | 加凝固剂，如：琼脂 | 观察微生物的运动、分类鉴定、保藏菌种 | |
固体培养基 | 微生物分离、鉴定、活菌计数、 | ||
化学成分 | 天然培养基 | 含化学成分不明确的天然物质 | 工业生产 |
合成培养基 | 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) | 分类、鉴定 | |
用途 | 选择培养基 | 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 | 培养、分离出特定微生物(如：培养酵母茵或霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐) |
鉴别培养基 | 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 | 鉴别不同种类的微生物，如可用伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，茵落呈深紫色，并带有金属光泽) |
说明：
①病毒为非细胞结构的生物体，专营活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。
②加入培养基中的凝固剂(如琼脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。
③选择培养基一般只生长具有特定的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。
注意：选择培养基的选择方法
(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌;加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。
(2)改变培养基中的营养成分。例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物;石油作为惟一碳源时，可以分离出消除石油污染的微生物。
(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。
(二)灭菌技术
1.无菌技术的概念
在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵，其主要技术是无菌操作。无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染。无菌技术主要围绕如何避免杂菌污染展开的。
2.消毒、灭菌的方法
项目 | 概念 | 常用方法 | 应用范围 |
消毒 | 使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分对人体等有害的微生物(不包括孢子和芽孢) | 巴氏消毒法：70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min | 一些不耐高温的物体如牛奶 |
煮沸消毒法：在100℃水浴中煮沸5～6 min | 一般物品 | ||
化学药剂消毒法：用乙醇、氯气、漂白粉、KMnO4等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖 | 可用来对环境、双手和衣物等消毒 | ||
紫外线消毒法：30W紫外灯照射30min | 接种室 | ||
灭菌 | 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 | 灼烧灭菌法：酒精灯火焰 | 接种工具如接种环、接种针等 |
干热灭菌法：在160～170℃加热1～2h | 如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具 | ||
高压蒸汽灭菌：压力为100 kPa，温度为12l℃的条件下，维持15～30 min | 培养基及容器的灭菌 |
注意：
①无菌操作是微生物培养过程中，防止杂茵污染的关键步骤。
②消毒只能消灭或抑制营养体的活动，而不能达到彻底灭菌。酒精消毒用体积分数为70%的酒精效果最好，因浓度过高，会使菌体表面蛋白凝固成一层保护膜，乙醇分子不能进入其中;浓度过低，杀菌力减弱。而灭菌除杀死营养体外，还必须杀死芽孢和孢子。
③灭菌消毒的原理，就是通过一定理化手段，使病原茵蛋白质变性，失去生命活性。