基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
操作过程
步骤一：目的基因的获取
目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金芽孢杆菌抗虫基因、植物抗病基因(抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。
原核细胞的基因结构
真核细胞的基因结构
获得目的基因的方法
1)从基因文库中获取目的基因
种类：
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库(如cDNA文库)：含有一种生物的部分基因
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根据基因的有关信息，如基因的转录产物mRNA等可以从基因文库中得到所需的目的基因。
2)利用PCR技术扩增目的基因
原理、过程、条件、扩增形式
3)人工合成(DNA合成仪)
适合基因比较小，且核苷酸序列已知
PCR技术—多聚酶链式反应
原理：
DNA双链复制
前提：
已知目的基因的核苷酸序列
原料：
四种脱氧核苷酸
DNA的两条链为模板
热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
引物
指数形式扩增
1.变性：目的基因DNA受热变性，解链为单链;
2.复性：引物与单链互补结合;
3.延伸：合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。
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步骤二：基因表达载体的构建(核心)
1.用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。
2.用同种限制酶切断目的基因，使其产生相同的粘性末端。
3.将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)。
基因表达载体的组成：
●目的基因
●启动子在基因的首端，它是RNA聚合酶的识别和结合的部位
●终止子在基因的尾端
●标记基因便于筛选检验
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
步骤三：将目的基因导入受体细胞
使目的基因进入受体细胞，并在其中维持稳定和表达的过程，称为转化。
常用的受体细胞
动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。
将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。 Ti质粒的T-DNA可转移并整合到受体细胞的染色体DNA上
将目的基因导入微生物细胞
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1.微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少2.常用菌：
大肠杆菌
3.转化方法：
Ca2+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
步骤四：目的基因的检测与鉴定
个体生物学鉴定—抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。
习题演练
1.有关基因工程的叙述中，错误的是( )
A.DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来
B.限制性核酸内切酶可用于目的基因的获得
C.目的基因可由运载体导入受体细胞
D.人工合成目的基因时不用限制性核酸内切酶
A
解析
DNA连接酶将黏性末端的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，A错。
限制酶能够识别特定核苷酸序列，从目的基因所在DNA切割获取目的基因，B正确。
目的基因要通过载体导入受体细胞，C正确。
人工合成目的基因可以根据已知目的基因序列或mRNA序列人工合成，D正确。
2.下列基因工程的操作顺序，正确的一组是( )
限量科a399网秀量学法af16优慧术广点点630404e6途术件521814a297c0c5ecb2df-44d7452f8a074cf39dd7公软的司习东学的4ebd元a138100e升499fd5a14e0a有西法技8447得
①目的基因的表达和检测
②目的基因与运载体结合
③将目的基因导入受体细胞
④目的基因的提取
A.①②③④
B.④③②①
C.④②③①
D.②③④①
C
解析
基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由此可见基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取;基因表达载体的构建;将目的基因导入受体细胞;目的基因的检测与鉴定。故C正确。
3.下列各选项中，a、b、c、d代表的结构说法正确的是( )
A.a—质粒RNA
B.b—DNA连接酶
C.c—限制性核酸内切酶
D.d—外源基因
D
解析
a代表质粒DNA，故A错误;b代表限制酶，故B错误;c代表DNA连接酶，故C错误;d代表外源基因，即目的基因，故D正确。
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