专题三 胚胎工程
1、胚胎工程
(1)概念：对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
(2)主要的技术手段：如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。
3.1 体内受精和早期胚胎发育
2、哺乳动物受精和胚胎发育的基本过程
(1)精子的发生：在睾丸内完成的。第一阶段：精原细胞进行有丝分裂，染色体复制，形成初级精母细胞;第二阶段：初级精母细胞进行减数分裂，产生含单倍染色体的精子细胞;第三阶段：圆形精子细胞变形成为精子(变形过程中，细胞核为精子头的主要部分，高尔基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜，其他物质浓缩为原生质滴直至脱落)。[线粒体为精子运动提供能量]
(2)卵子的发生：在雌性动物的卵巢内完成。在胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞(被卵泡细胞包围);初级卵母细胞经减数分裂形成成熟的卵子(减数第一次分裂在排卵前后完成，形成次级卵母细胞和第一极体，并进入输卵管准备受精;减数第二次分裂是在受精过程中完成的，次级卵母细胞分裂产生一个成熟卵子和第二极体。
★ 当在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志。
★ 哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前(即胎儿时期)完成的。这是精子与卵子在发生上的重要区别。
(3)受精：是精子与卵子结合形成(即受精卵)的过程。包括受精前的准备阶段和受精阶段。
★ 准备阶段1：精子获能(在雌性动物生殖道内);
★ 准备阶段2：卵子的准备(排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减数第二次中期才具备受精能力)
★ 受精阶段：精子穿越放射冠和透明带，进入卵细胞膜，原核形成和配子结合。具体过程如下：[卵子周围的结构由外到内：放射冠、透明带、卵细胞膜]
n a)顶体反应：精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠。
n b)透明带反应：顶体酶可将透明带溶出孔道，精子穿入，在精子触及卵细胞膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障];
n c)卵细胞膜的封闭作用：精子外膜和卵细胞膜融合，精子入卵后，卵细胞膜会拒绝
其他精子再进入卵内的过程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障];精子尾部脱落，原有核膜破裂形成雄原核，同时卵子完成减数第二次分裂，形成雌原核
★ 注意：受精标志是在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体;
★ 受精完成标志是雌雄原核融合成合子]。
★ 自然条件下，受精是在母体的输卵管上段完成的。
(4)胚胎发育：a卵裂期：受精卵细胞进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积不增加，或略有减小。
b桑椹胚：胚胎细胞数目达32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。
c囊胚：细胞开始分化(该时期细胞的全能性仍比较高)，其中聚集在胚胎一端个体较大的细胞叫内细胞团，将来可发育成胎儿的各种组织;而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘;胚胎内部的空腔称为囊胚腔。(注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化);
d原肠胚：有了三胚层的分化，内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。[细胞分化在胚胎期达到最大限度]
3.2 体外受精和胚胎的早期培养
3、体外受精：
哺乳动物的体外受精：主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。属于有性生殖过程。
(1)卵母细胞的采集和培养：对体型小的动物用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，从输卵管冲取卵子(可直接与获能的精子在体外受精);对体型大的动物从卵巢中直接或间接(借助超声波探测仪、腹腔镜等)采集卵母细胞。(卵母细胞要在体外人工培养成熟后，才能与获能的精子受精)。
(2)精子的采集和获能：假阴道法、手握法和电刺激法;获能：对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法(放入人工配制的获能液中);对牛、羊等精子用化学法(放在肝素或钙离子载体溶液中);在体外受精前，要对精子进行获能处理。精子获能的方法有：培养法和化学法两种。
(3)受精：获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下都可以在获能溶液或专用受精溶液中完成受精过程。
4、胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。
a)培养液成分：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等[注意与动物细胞培养液成分的比较];
b)胚胎发育到适宜阶段时，可将培养的胚胎取出，向受体移植或冷冻保存。
不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植;小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在8-16个细胞阶段移植。)
3.3 胚胎工程的应用
目前，胚胎工程应用较多的是家畜的胚胎移植、胚胎分隔、体外生产胚胎技术。
5、胚胎移植：
(1)概念：将雌性动物的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。
l 其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。(供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。)
l 是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程，通过转基因、核移植、体外受精获得的胚胎必须移植给受体才能获得后代。是胚胎工程的最后一道“工序”。
(2)优势：可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期。
(3)胚胎移植的生理学基础：
★ 同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的[对供体和受体进行同期发情处理];
★ 早期胚胎形成后处于游离状态，为胚胎的收集提供可能;
★ 受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体的存活提供了可能;
★ 供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
(4)胚胎移植的程序：
① 对供、受体母牛进行选择，选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。用激素进行同期发情处理;
② 对供体母牛用促性腺激素做超数排卵处理;
③ 选同种优秀公牛配种或人工授精[有性生殖过程];
④ 对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的早期胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。
⑤ 对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段。
⑥ 直接向受体进行胚胎移植或放入-196℃的液氮中保存。
⑦ 胚胎移植;
⑧ 移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
⑨ 产下胚胎移植的犊牛。
6、胚胎分割：
(1)概念：用机械方法将早期胚胎切割成2、4、8等分等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。由于来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看作是动物无性繁殖或克隆的方法之一。
(2)基本过程：选择良好的桑椹胚或囊胚(期间的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可以用于胚胎分割)移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。(注意：对囊胚阶段的胚胎分割时，内细胞团要均等分割，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育)。
7、胚胎干细胞(ES或EK细胞)
(1)概念：由早期胚胎(囊胚)或原始性腺(胎儿)中分离出来的一类细胞，又叫ES或EK细胞。
(2)特征：具有胚胎细胞的特征，在形态上体积小、细胞核大、核仁明显;功能上具有发育的全能性，即可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。在体外培养下，ES细胞可以只增殖不分化;可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。
(3)应用：用于治疗人类疾病，如利用ES细胞诱导其分化成新的组织细胞特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复。
8、胚胎干细胞的主要用途有：
① 可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律;
② 是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段;
③ 可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等;
④ 利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能;
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⑤ 随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。